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チップの設計と製造

チップはAutoCAD（Autodesk）を使用して設計され、3D印刷用に.STLファイルとしてエクスポートされました。 MCRをエンコードするCCは、filaments.caから購入した透明樹脂（Rapid Model Resin Clear、Monocure 3D）を使用して、デジタルマイクロミラーディスプレイ（DMD）3Dプリンター（Miicraft 100、Creative Cadworks）で作成されました。 次の印刷パラメータを使用しました。層の厚さは20µm、露光時間は1層あたり1.5秒でしたが、ベース層の露光時間は4つの遷移バッファ層で10秒でした。 印刷の完了後、チップをイソプロパノールで洗浄し、紫外線（UV）光（Professional CureZone、Creative Cadworks）の下で1分間後硬化しました。

断面積が250×100〜1,500×1,000 µmのマイクロチャネル2 は、約30％の出力で10秒間プラズマ活性化することにより製造され、親水化されました（PE50プラズマチャンバー、プラズマエッチング）。

CCは、カバーを形成する遅延粘着テープ（9795Rマイクロ流体テープ、3M）で密封されました。

ペーパーキャピラリーポンプ

濾紙（ワットマン濾紙グレード4、1および50硬化、Cytiva）は、SARS-CoV-2抗体アッセイを除くすべての実験で紙キャピラリーポンプとして使用されました。 硬化した4、1、50の細孔径は降順であり、細孔径が小さくなると流動抵抗と毛細管圧が増加します。

SARS-CoV-2抗体アッセイでは、吸収パッド（電気泳動およびブロッティングペーパー、グレード238、Ahlstrom-Munksjoクロマトグラフィー）をポンプとして使用しました。

300のキャピラリーフローイベントのチップ間接続

漏れのない接続を得るために、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（PEG-DA MW 258、Sigma-Aldrich）とIrgacure-819（1％w / w）を混合して調製した未硬化のフォトレジンの薄層をすべてのチップ間インターフェース。 次に、チップを組み立て、UVチャンバー（320〜390 nm、UVitron Intelliray 600）で50％の強度で30秒間UV光にさらして、樹脂を硬化させ、接続をシールしました。

ビデオと画像処理

ビデオと画像は、PanasonicLumixDMC-GH3Kを使用して記録されました。 チップと埋め込まれた導管の構造画像は、マイクロコンピューター断層撮影（Skyscan 1172、Bruker）を使用して取得され、寸法を確認するために使用されました。 接触角は側面図の画像に基づいて測定されました（n = 3）そしてImageJのDropsnake拡張機能を使用して分析されました。

モデリングと計算

キャピラリーSVの理論的な破裂圧力は、COMSOLMultiphysicsv.5.5で有限要素法を使用して流れ場を解くことによって計算されました。 実験的に測定された接触角（カバーとチャネルでそれぞれ100°と40°）を使用して、レベルセット法を使用した2相キャピラリーフローを解決しました。 SVに至るまでのキャピラリーフローは、1×10のタイムステップで0〜0.02秒の時間で解決されました。−5s。 バーストが観察されるまで、各シミュレーションで入口圧力を10Paずつ変化させました。

キャピラリーSVおよびRBVの圧力しきい値に関する実験

さまざまな断面積のSV/RBVを評価するために、モジュールを3D印刷しました。 各モジュールには、複製結果用に3つのSV/RBVが含まれていました。 SV / RBVは、他の場所で説明されているように、幾何学的チャネル拡張に基づく2レベルのSVで構成されていました。12 。 チップは、マイクロ流体フローコントローラーシステム（MFCS-4C）へのチューブ接続用の円錐形の入口/出口とMilliQ水溶液に5％の赤色食用色素を含む流体リザーバーを備えたFluiwellパッケージ（Fluigent）を統合しました（セットアップについては拡張データ図4を参照）画像および接触角については図2）。 MAESFLO v.3.3.1ソフトウェア（Fluigent）は、正圧または負圧の適用を制御して、SV（エアリンクへの液体バースト）およびRBV（メニスカスの後退）の破裂圧力を0.1 mbar（約10 Pa）刻みで計算しました。 。

SARS-CoV-2抗体アッセイ

試薬

SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質はSinoBiological、Inc.（40588-V08B）から購入しました。 SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質に対するヒトキメラ抗体はGenscriptBiotech（A02039）から購入しました。 SIGMAFAST 3,3′-ジアミノベンジジン錠剤は、Sigma-Aldrichから購入しました。 ビオチン化ヤギ抗ヒト抗体はCedarlane（GTXHU-003-DBIO）から購入しました。 ピアスストレプトアビジンポリHRP（21140）はThermoFisherから購入しました。

ニトロセルロースストリップ

ニトロセルロースメンブレン（Whatman FF80HP Plusニトロセルロースで裏打ちされたメンブレン、Cytiva）を、Silhouette Portraitペーパーカッター（Silhouette）を使用して幅5.2mmのストリップにカットしました。 膜は、0.25mgmlの5mm幅のテストラインで縞模様にされました。-1プログラム可能なインクジェットスポッター（sciFLEXARRAYER SX、Scienion）を使用して送達されるSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質。 テストラインは、互いに100 µm離れて印刷された約350plの50個の液滴の4つのレーンで構成されています。 パス間の溶液吸収を可能にするために、偶数および奇数の位置の各レーンに25個の液滴の8つのパスが使用されました。 次に、膜を37°Cで1時間乾燥させた後、1×PBS溶液中の1％BSAに完全に湿るまで浸してブロッキングし、回収して37°Cで1時間乾燥させた後、乾燥剤とともに4°で保存しました。翌日使用するまでC。

キャピラリーポンプとニトロセルロースチップのMCRチップへの接続

ニトロセルロースストリップは、標準的なイムノクロマトグラフィーアセンブリプロトコルに従って取り付けられました。 ニトロセルロースストリップは、一方の端でガラス繊維コンジュゲートパッド（G041 SureWick、Millipore Sigma）に接続され、もう一方の端でキャピラリーポンプとして機能する吸収パッド（電気泳動およびブロッティングペーパー、グレード238、Ahlstrom-Munksjoクロマトグラフィー）に接続されました。 。 3つすべてが裏打ち層として機能する粘着テープに取り付けられました。 唾液抗体アッセイでは、ニトロセルロースストリップを3つの吸収パッド（15×25 mm）の間に挟みました。2）そしてペーパークリップで固定します。 食用色素のデモンストレーション用に、単一の吸収パッド（25×45 mm2 ）をニトロセルロース膜に磁気的に固定した。

唾液アッセイプロトコル

ヒト唾液を経口スワブ（SalivaBio、Salimetrics）で抽出した後、遠心分離し、1％BSA、0.1％Tween20を含む0.22µMろ過リン酸緩衝生理食塩水で1:10希釈しました。SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質に対するヒトキメラ抗体0〜1,000 ng ml-1希釈した唾液にスパイクし、サンプルリザーバーにロードしました。 0〜10ngmlの濃度の3回の反復測定-1 、30〜300ngmlの濃度で2回の繰り返し測定-1そして1,000ngmlの1つの測定-1 。 0.5 µgmlのビオチン化ヤギ抗ヒト抗体-1 0.5 µgmlのストレプトアビジンポリHRP-1ヒト抗体の検出に使用されました。 ニトロセルロースストリップのコントロールラインは、試薬の供給と比色反応の完了を確認します。

ニトロセルロースストリップの画像分析

すべてのリザーバーを排出した後、ニトロセルロースメンブレンストリップを取り外し、支持体上に置き、1時間乾燥させた。

ドライストリップは、（1）600 dpiの解像度でフラットベッドスキャナー（mfc-9970cdw、Brother）を使用し、（2）12メガピクセルのイメージセンサーを備えたHuaweiP10スマートフォンと27mmの焦点長を備えたリアカメラを使用して画像化されました。 （Huawei）カスタマイズされたボックス。 スマートフォンで撮影する際に周囲の光を遮るために、箱を黒の板紙でカットして折りたたんだ。 ボックスには、カメラとニトロセルロースストリップのサイズにそれぞれ適合する2つのスロットがあり、読み取り用のストリップの正確な位置合わせを保証します。 画像は、フルパワーのオンカメラデュアルトーン発光ダイオードフラッシュで撮影されました。 スマートフォンで撮影およびスキャンした画像の分析は、次のように行われました。

ニトロセルローステストラインの平均グレー値は、100×10ピクセルの長方形の領域内でImageJ 1.48v（ImageJ、パブリックドメインソフトウェア、W。Rasband、国立衛生研究所）を使用して抽出されました。 ローカルバックグラウンドグレー値は、同じ長方形の領域の各テストライン（流れの方向に従う）の2.5 mm（0.1インチ）上で取得され、テストライン値から差し引かれました。 次に、負のコントロールシグナル値（0 ng ml）を差し引くことにより、正規化された検量線を作成しました。-1）すべてのデータポイントから。

検出限界は、OriginPro 8.5 SPR（OriginLab Corporation）で対数変換されたデータの非線形4パラメーターロジスティックカーブフィットを使用した3シグマ基準を使用して計算されました。

自動化されたマイクロ流体TGA（トロンボチップ）

クエン酸ヒト血漿（P9523、ロット番号SLBX8880）、蛍光発生トロンビン基質Z-GGR-AMC、およびエノキサパリンはSigma-Aldrichから購入しました。 バトロキソビンはプロスペックからのものでした。 テクノトロンビンTGARCHigh試薬はDiapharmaからのものでした。 ヒトトロンビン、第V因子および第IX因子が免疫枯渇し、第VIII因子が不活化された非患者血漿は、HaematologicTechnologiesからのものでした。 （4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸）（HEPES）、およびエチレンジアミン四酢酸（EDTA）とCaCl2 Sigma-Aldrichから来ました。

購入したプールされたヒト血漿（米国で食品医薬品局の認可センターサイト番号268に収集され、製造元から提供された原産地証明書に指定されています）は、標準的な業界の方法で収集された全血から製造元によって調製されました。抗凝固剤として4％クエン酸三ナトリウムをプールし、遠心分離しました。 得られた血漿を0.45µmでろ過し、凍結乾燥しました。 第V因子および第IX因子が枯渇した血漿は免疫が枯渇した。 第VIII因子枯渇血漿は、化学的枯渇によって調製されました。 血漿調製物は、製造業者によって残りの因子の活性を確実にするためにアッセイされた。

ヒト血漿（プールされた正常または因子枯渇）は、バトロキソビン（最終濃度0.6 BU ml）の添加により脱線維化されました。-1 ）。 混合物を室温で20分間インキュベートした後、4°Cで1時間さらにインキュベートしました。 次に混合物を10,000℃で遠心分離した。gフィブリン血餅および他の破片を取り除くために10分間。 脱線維化血漿を上澄みから収集した。

21％の脱線維化血漿（フィブリン血餅によるマイクロ流体チャネルの詰まりを防ぐために血漿脱線維化が必要）、48％のテクノトロンビンTGA RC高試薬（高リン脂質および再脂質化組織因子含有量）および20mMCaClを含む溶液2 pH7.4の25mMHEPESをトロンボチップのサンプルリザーバーにロードしました。 pH7.4の25mMHEPESに420µM Z-GGR-AMC、30mMEDTAを含む基質溶液を試薬リザーバーにロードしました。 血漿、活性化剤および基質の濃度は、150nMおよび200秒のピークトロンビン濃度および時間をもたらすように最適化された。 ロードする前に、すべての溶液を室温で20分間平衡化しました。 凝固阻害血漿には、0〜1.0抗Xa単位mlの最終濃度のエノキサパリンが含まれていました。-1またはIUml-1。 凝固カスケードを開始した後、サンプルと試薬をチップにロードしました。 ペーパーポンプをチップに接続して、凝固カスケードを開始してから5分後にフローを開始しました。 反応チャンバーで生成された蛍光シグナルは、トロンボチップを365nmのUV光で20W（realUV LED Flood Light、Waveform Lighting）で照射し、可視440nmの蛍光発光シグナルをPanasonicLumixを使用して5秒間隔でイメージングすることでモニターしました。 DMC-GH3Kデジタルカメラ（f / 3.5、露光時間：2秒、ISO-200）。 各反応チャンバーでの蛍光シグナル生成速度（つまり、記録された蛍光生成曲線の傾き）は、トロンビンによる基質代謝回転の速度の尺度であり、標準曲線を使用して生成されたトロンビンの量を推定するために使用されました。 画像Jを使用して、画像の蛍光強度を分析しました。

トロンビン定量化の標準曲線

pH7.4の25mMHEPES中の0〜300 nMの範囲の濃度の10個のヒトトロンビン溶液を、トロンビンチップの10個のサンプルリザーバーにロードしました。 pH7.4の25mMHEPESに420µM Z-GGR-AMC、30mMEDTAを含む基質溶液を試薬リザーバーにロードしました。 標準曲線は、対応するサンプルリザーバーにロードされた溶液の既知のトロンビン濃度に対して、各反応チャンバーで記録された蛍光生成曲線の傾きをプロットすることによって作成されました。

レポートの概要

研究デザインの詳細については、このペーパーにリンクされているNature ResearchReportingSummaryを参照してください。

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